Знаете, как скрестить мышь с медузой? Или, может быть, хотите научиться собирать конструктор из вируса, человека и быка? В нашем курсе мы расскажем вам о том, какие «пазлы» уже умеют складывать учёные и как трансгенные технологии влияют на нашу жизнь. ГМО — эти три буквы держат в страхе весь мир. Сегодня больше 80% россиян боятся генетически модифицированных организмов, не подозревая о том, что их собственные организмы в своё время уже подверглись генетической модификации. На протяжении миллионов лет вирусы, первые «генные инженеры», успешно меняли геном человека, и каждый из нас на целых 8% вирус. Из нашего курса вы узнаете, что же такое ГМО и зачем человек создал технологии трансгенеза, как работает трансгенная конструкция и какими способами её можно доставить в клетку. Мы познакомим вас с новейшими системами редактирования генома, расскажем о том, как трансгенные животные помогают исследователям в борьбе с наследственными заболеваниями и старением. Вы собственными глазами увидите светящихся рыбок и мышей и побываете в лаборатории, где из опаснейших вирусов делают безопасные для того, чтобы они служили на пользу человечеству. Добро пожаловать на курс «ГМО: технологии создания и применение». Мы научим вас делать из мухи слона!
2.1. Ctrl+C для ДНК: полимеразная цепная реакция
Loading...
From the course by Novosibirsk State University
ГМО: технологии создания и применение
169 оценки
From the lesson
Создание трансгенных организмов
Второй модуль делится на 2 части. В первой из них мы расскажем и покажем, как в лаборатории создаются трансгенные конструкции и какие методы позволяют генным инженерам объединять в трансгенной конструкции ДНК самых разных видов. Из второй части модуля вы узнаете о самом распространённом способе создания трансгенных животных. Например, о том, как обычную козу можно превратить в биофабрику по производству белков человека. Кроме того, мы разберём молекулярные механизмы, встраивающие чужеродную ДНК в геном.
Meet the Instructors
Алексей Мензоровкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Нариман Баттулинкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Вениамин Фишманкандидат биологических наук, преподаватель
Кафедра молекулярной биологии факультета естественных наук НГУ
[ЗВУК] [ЗВУК] Здравствуйте!
Меня зовут Вениамин, и я буду читать часть лекций в этом курсе.
Сегодня мы поговорим о том,
как создавать конструкции для получения трансгенных организмов.
Вы уже знаете, что большинство, если не все элементы,
из которых состоят такие конструкции, позаимствованы биологами у природы,
то есть они содержатся в геномах тех или иных живых организмов.
Но в то же время вы знаете, что именно в той комбинации, в которой нам нужно,
элементы конструкции для получения трансгенного организма ни в каком из живых
организмов не представлены.
Как же нам быть?
Нам нужно научиться, значит, извлекать эти необходимые элементы из геномов
живых организмов и комбинировать их друг с другом.
Вот об этом мы будем говорить в течение нескольких лекций,
а сегодня поговорим именно о том,
как извлечь какую-то последовательность ДНК из генома организмов.
Сначал вспомним школьную программу о том, что же, вообще, такое ДНК.
Ну, ДНК — это химическая молекула,
основными строительными блоками которой являются химические вещества нуклеотиды.
Их бывает четыре типа, мы будем называть их буквами, и мы будем говорить,
что есть четыре буквы: А, Т, Г и Ц.
ДНК — это двухцепочечная молекула,
то есть одна длинная молекула ДНК состоит из двух цепей, и буквы,
которые составляют каждую из этих цепей, располагаются в них неслучайным образом.
Если в одной цепи находится буква А, то в другой цепи обязательно находится буква Т,
если в одной цепи буква Г, то в другой буква Ц.
Это называется правило комплементарности,
как будто буквы комплименты друг другу делают.
А всегда делает комплименты Т, а Г всегда делает комплименты Ц.
При этом А никогда не может стоять напротив Ц.
Это обусловлено химической природой самих веществ, которые, собственно,
и являются вот этими буквами, азотистых оснований.
Затем нужно сказать, что комплементарные участки ДНК комплементарны,
то есть вот именно такие, у которых нужные буквы — А напротив Т, Т напротив А,
Г напротив Ц, Ц напротив Г — они стремятся связаться друг с другом,
то есть они не просто вот так случилось, что они стоят друг напротив друга.
Как только у них появляется такая возможность, это для них именно
очень хорошо и очень выгодно соединиться друг с другом в двухцепочечную молекулу.
Теперь, когда мы вспомнили, что такое ДНК, поговорим о том,
как же извлечь какой-то фрагмент из этой молекулы.
На самом деле, я тут немножко слукавил.
Мы не то чтобы извлекаем какие-то фрагменты, мы просто берем исходную
геномную ДНК в очень небольшом количестве, а затем копируем какой-то нужный нам
элемент, какой-то нужный нам участок очень-очень-очень много раз,
так много раз, что в конечном счете у нас получается совсем-совсем чуть-чуть
исходные длинные молекулы, геномные ДНК, и огромное количество нужного нам фрагмента,
так что в сумме можно даже пренебречь исходной длинной молекулой.
Как же это делать?
Ключевую роль в этом процессе копирования,
которая называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР, играет фермент.
Ферменты, это вы помните, такие биологической природы катализаторы,
и фермент, который копирует ДНК, называется ДНК-полимераза.
Работает она в специальном буфере, который содержит определенные соли,
без них фермент неактивен.
И она строит новую молекулу ДНК из букв, вот этих самых букв — А, Т, Г, Ц.
То, какой же именно участок будет строить фермент ДНК-полимераза,
определяет праймер.
Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент ДНК.
То есть, обратите внимание, до этого все фрагменты, о которых мы говорили,
были двухцепочечными, а это одноцепочечный фрагмент,
который комплементарен началу или концу участка ДНК, который мы хотим скопировать.
Комплементарен — то есть содержит те самые нужные буквы: напротив А Т,
напротив Т — А.
Если комплементарен участку ТТТ, значит, содержит буквы ААА.
Еще одна особенность праймера заключается в том, что его концы,
начало и конец, неодинаковые.
Только с одним из концов может связаться ДНК-полимераза.
На рисунке этот конец обозначен стрелочкой.
И, собственно, то, с каким концом праймера связывается ДНК-полимераза,
определяет то, в каком направлении она будет двигаться, синтезируя новую цепь.
На самом деле, для того чтобы ДНК-полимераза начала синтез,
ей недостаточно только праймера.
Ей нужен короткий двухцепочечный участок,
образованный одной из цепей матрицы и праймером.
Для того чтобы праймер соединился с одной из цепей матрицы, он,
естественно, должен быть этому участку цепи комплементарным.
Таким образом, конец праймера определяет, в каком направлении будет идти синтез,
а то, из каких букв состоит праймер, определяет,
в каком месте он свяжется с ДНК-матрицей,
потому что он может связаться только с комплементарным участком.
Вы помните, что некомплементарные буквы друг с другом взаимодействовать не хотят.
Итак, теперь, когда мы разобрали все необходимые теоретические моменты,
давайте обсудим, как, собственно, проходит полимеразная цепная реакция.
Мы смешиваем в пробирке несколько компонент, а именно: матрицу для синтеза,
то есть длинную геномную ДНК, двухцепочечную; буфер; буквы,
А, Т, Г, Ц, или нуклеотиды по-другому; праймеры — это
одноцепочечные короткие фрагменты, которые комплементарны началу фрагмента,
который мы хотим получить, и концу фрагмента, который мы хотим получить,
то есть у нас должно быть два праймера — один для начала фрагмента,
другой — для конца фрагмента; и ДНК-полимеразу.
Ну, казалось бы, чтобы начался синтез,
у нас праймеры должны связаться с одной из цепей ДНК хотя бы.
Ну, каждый праймер со своей цепью.
Но этого не происходит, потому что ДНК уже двухцепочечная молекула,
и в ней цепи уже комплементарны друг другу.
Им хорошо вместе, и третий здесь лишний.
Для того чтобы разлучить цепи ДНК друг с другом, вы помните,
что для них это, вообще-то,
энергетически выгодно вместе находиться, нам нужно нашу реакцию нагреть.
Мы нагреваем реакцию до температуры примерно 95–98 градусов,
и при такой температуре цепи ДНК расходятся, отходят друг от друга.
На самом деле праймеры все еще не могут связаться при этом с той или иной цепью
ДНК, потому что температура реакции слишком высокая.
Да, цепи теперь стремятся с кем-то связаться,
но мы же подняли температуру и только что поговорили о том, что это приводит к тому,
что связи между цепями ДНК при этом рушатся.
Поэтому для того чтобы праймеры смогли, наконец, воссоединиться с комплементарными
им участками матрицы, то есть геномной ДНК, необходимо температуру опустить.
Мы опускаем температуру примерно до 60 градусов, это зависит от, на самом деле,
конкретных праймеров и матрицы, ну, будем считать,
около 60 градусов где-то в среднем.
И при такой температуре вы видите, что праймеры связываются с
соответствующими цепями ДНК, причем обратите внимание,
именно в комплементарных участках и именно в конце и в начале нашего фрагмента,
то есть на самом деле мы сделали праймеры так, чтобы ДНК-полимераза,
когда вот она сейчас связалась с нашим комплексом праймера и матрицы,
она от начала нашего фрагмента двигалась вправо,
а от конца нашего фрагмента двигалась влево.
Но для того чтобы вообще синтез начался,
и ДНК-полимераза начала синтезировать новые последовательности ДНК,
необходимо обеспечить комфортную для ее работы температуру,
для разных ДНК-полимераз эта температура разная, обычно это около 72 градусов.
Поэтому мы еще поднимаем температуру до 72 градусов.
Теперь процесс пошел.
ДНК-полимераза синтезирует одну цепь ДНК и включает в нее буквы, комплементарные
матрице, то есть опять же напротив Т ставит А, напротив Г ставит Ц и так далее.
И ДНК-полимераза так двигается,
как вы можете здесь увидеть на этой схеме, синтезируя новую цепь какое-то время.
На самом деле, какое время, определяется двумя параметрами.
Во-первых, ДНК-полимераза просто не может двигаться вечно,
и включив определенное количество букв в растущую цепь,
— обычно это несколько тысяч, не больше, — она устает и отваливается.
Но на самом деле можно контролировать, как долго будет идти синтез ДНК, еще и изменяя
температуру в реакции после какого-то определенного промежутка времени.
То есть, например, если мы снова нагреем реакцию до 98 или 95 градусов,
то ДНК-полимераза отвалится от ДНК в тот момент, когда мы это сделаем.
Таким образом, длина продукта определяется временем,
которое ДНК-полимераза синтезирует новую цепь.
Итак, как я уже сказал, мы,
после того как ДНК-полимераза какое-то время включала буквы в новую цепь,
поднимаем температуру снова, и у нас возвращается все к исходной ситуации,
когда цепи разделились друг с другом, но только теперь цепей у нас стало больше.
Кроме имевшейся в реакции матрицы еще есть две новые синтезированные цепи.
И теперь мы повторяем все сначала.
Мы опускаем температуру до 60 градусов,
и вы видите, как с исходными молекулами матрицы,
так и с вновь синтезированными молекулами могут связаться снова праймеры.
Это и происходит.
И мы снова поднимаем температуру до 72 градусов,
и у нас снова происходит синтез молекул при помощи ДНК-полимеразы.
Мы повторяем такой цикл: 98 — 60 — 72 еще раз,
и еще раз, и еще раз.
Посмотрите на изображение.
Посмотрите на видео, что происходит.
У нас образуется все больше и больше цепей,
причем большинство из этих цепей цепей.
Это как раз те фрагменты, которые мы хотели бы получить,
то есть короткие фрагменты,
ограниченные одним нашим праймером в начале и другим наши праймером — в конце.
Ну, вы помните, что праймеры мы подбирали таким образом,
чтобы у нас один из них именно соответствовал началу необходимого нам
фрагмента и второй соответствовал концу необходимого нам фрагмента.
То есть то, что мы получаем в конце, в большей степени,
по большинству — это именно те...
тот фрагмент, который мы хотели бы наработать,
тот участок исходной матричной ДНК, которую мы хотели бы наработать.
Есть и другие фрагменты, вы видите.
Это как исходная матрица, так и более длинные фрагменты, которые только с одной
стороны содержат наш праймер, а со второй стороны закончились тем,
что просто ДНК-полимераза отвалилась по какой-то причине от матрицы,
или из-за того, что температура поднялась, или из-за того,
что она просто устала (как мы это называем, да?) синтезировать новую ДНК.
Но таких длинных молекул намного меньше, чем нужных нам коротких.
Можно посчитать, что через 35 циклов у нас коротких молекул будет примерно
17 миллиардов, а длинных молекул, которые содержат праймер на одном конце,
около 35 копий, а молекул исходной матрицы — всего одна копия,
что на самом деле по сравнению с 17 миллиардами — совершенно мизерное
количество, которым можно спокойно пренебречь, и считать, что на выходе у нас
получились только нужные нам целевые вот эти вот короткие участки.
Ну, собственно, вот таким образом, при помощи полимеразной цепной реакции
можно практически любой участок исходной ДНК наработать в таком количестве,
что дальше забыть просто про исходную ДНК и все остальные примеси в этой реакции.
На самом деле ПЦР — не такой абсолютно приемлемый во всех ситуациях метод,
как может показаться на первый взгляд.
У него есть ряд ограничений.
Первое важное ограничение — это специфичность праймеров.
На самом деле молекулы исходной геномной ДНК очень длинные,
и очень часто так случается, что то,
что является началом нашего искомого фрагмента, элемента,
та последовательность, которую мы хотели бы включить в праймер или комплиментарная
ей последовательность, встречается в геноме не один раз, а несколько.
И тогда, когда мы подбираем праймеры, может оказаться,
что они случайным образом свяжутся не с нужной нам последовательностью,
а с какой-то другой, и на выходе наш ПЦР-продукт, то есть то,
что мы получим в результате ПЦР-реакции будет совсем не тем, что мы хотим.
Вторая проблема — это длина продукта.
Как я сказал, даже если мы будем очень долго поддерживать температуру,
комфортную для ДНК-полимеразы, то есть при которой она может синтезировать,
она все равно через максимум несколько тысяч букв, нуклеотидов,
отвалится от ДНК и прекратит синтез.
Этим лимитирован максимальный размер ПЦР-продукта,
который может вообще образоваться в реакции.
Для большинства случаев это несколько тысяч нуклеотидов, ну,
в некоторых случаях, используя специальные ДНК-полимеразы,
можно получить продукты большие, несколько большие, чем 10000 букв или нуклеотидов.
Ну, существенно больше, чем вот этот предел в 10000, поднять эффективность
реакции уже нельзя, то есть сделать существенно больше продукта нельзя.
Ну, тем не менее, эти проблемы можно решить с помощью других методов,
о некоторых из них мы будем говорить буквально в следующей лекции.
Зато у метода ПЦР есть много преимуществ.
Одно из них, которое мы сейчас обсудим,
совершенно замечательное и оно связано с тем, что на самом деле я сказал,
что праймер должен быть комплиментарен матрице.
Но это не совсем так.
Комплиментарен должен быть только небольшой участок праймера,
который находится вот именно на том конце, где будет связывание с ДНК-полимеразой,
где у нас была стрелочка нарисована.
На другом конце праймера можно добавлять нуклеотиды или буквы,
которые не комплиментарны матрице.
А поскольку все наши получаемые фрагменты, вот эти короткие фрагменты,
которые нам нужны, они содержат праймеры на своих концах, то получается,
что все наши фрагменты на концах могут содержать какие-то последовательности,
которые, вообще говоря, исходно в матрице не присутствовали.
И это очень удобно и полезно для последующих методов,
о которых мы поговорим в следующей лекции.
Ознакомьтесь с нашим каталогом
Присоединяйтесь бесплатно и получайте персонализированные рекомендации, обновления и предложения.
Coursera делает лучшее в мире образование доступным каждому, предлагая онлайн-курсы от ведущих университетов и организаций.
© Coursera Inc., 2018 Все права защищены.
