[ЗВУК] [ЗВУК] Здравствуйте! Меня зовут Вениамин, и я буду читать часть лекций в этом курсе. Сегодня мы поговорим о том, как создавать конструкции для получения трансгенных организмов. Вы уже знаете, что большинство, если не все элементы, из которых состоят такие конструкции, позаимствованы биологами у природы, то есть они содержатся в геномах тех или иных живых организмов. Но в то же время вы знаете, что именно в той комбинации, в которой нам нужно, элементы конструкции для получения трансгенного организма ни в каком из живых организмов не представлены. Как же нам быть? Нам нужно научиться, значит, извлекать эти необходимые элементы из геномов живых организмов и комбинировать их друг с другом. Вот об этом мы будем говорить в течение нескольких лекций, а сегодня поговорим именно о том, как извлечь какую-то последовательность ДНК из генома организмов. Сначал вспомним школьную программу о том, что же, вообще, такое ДНК. Ну, ДНК — это химическая молекула, основными строительными блоками которой являются химические вещества нуклеотиды. Их бывает четыре типа, мы будем называть их буквами, и мы будем говорить, что есть четыре буквы: А, Т, Г и Ц. ДНК — это двухцепочечная молекула, то есть одна длинная молекула ДНК состоит из двух цепей, и буквы, которые составляют каждую из этих цепей, располагаются в них неслучайным образом. Если в одной цепи находится буква А, то в другой цепи обязательно находится буква Т, если в одной цепи буква Г, то в другой буква Ц. Это называется правило комплементарности, как будто буквы комплименты друг другу делают. А всегда делает комплименты Т, а Г всегда делает комплименты Ц. При этом А никогда не может стоять напротив Ц. Это обусловлено химической природой самих веществ, которые, собственно, и являются вот этими буквами, азотистых оснований. Затем нужно сказать, что комплементарные участки ДНК комплементарны, то есть вот именно такие, у которых нужные буквы — А напротив Т, Т напротив А, Г напротив Ц, Ц напротив Г — они стремятся связаться друг с другом, то есть они не просто вот так случилось, что они стоят друг напротив друга. Как только у них появляется такая возможность, это для них именно очень хорошо и очень выгодно соединиться друг с другом в двухцепочечную молекулу. Теперь, когда мы вспомнили, что такое ДНК, поговорим о том, как же извлечь какой-то фрагмент из этой молекулы. На самом деле, я тут немножко слукавил. Мы не то чтобы извлекаем какие-то фрагменты, мы просто берем исходную геномную ДНК в очень небольшом количестве, а затем копируем какой-то нужный нам элемент, какой-то нужный нам участок очень-очень-очень много раз, так много раз, что в конечном счете у нас получается совсем-совсем чуть-чуть исходные длинные молекулы, геномные ДНК, и огромное количество нужного нам фрагмента, так что в сумме можно даже пренебречь исходной длинной молекулой. Как же это делать? Ключевую роль в этом процессе копирования, которая называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР, играет фермент. Ферменты, это вы помните, такие биологической природы катализаторы, и фермент, который копирует ДНК, называется ДНК-полимераза. Работает она в специальном буфере, который содержит определенные соли, без них фермент неактивен. И она строит новую молекулу ДНК из букв, вот этих самых букв — А, Т, Г, Ц. То, какой же именно участок будет строить фермент ДНК-полимераза, определяет праймер. Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент ДНК. То есть, обратите внимание, до этого все фрагменты, о которых мы говорили, были двухцепочечными, а это одноцепочечный фрагмент, который комплементарен началу или концу участка ДНК, который мы хотим скопировать. Комплементарен — то есть содержит те самые нужные буквы: напротив А Т, напротив Т — А. Если комплементарен участку ТТТ, значит, содержит буквы ААА. Еще одна особенность праймера заключается в том, что его концы, начало и конец, неодинаковые. Только с одним из концов может связаться ДНК-полимераза. На рисунке этот конец обозначен стрелочкой. И, собственно, то, с каким концом праймера связывается ДНК-полимераза, определяет то, в каком направлении она будет двигаться, синтезируя новую цепь. На самом деле, для того чтобы ДНК-полимераза начала синтез, ей недостаточно только праймера. Ей нужен короткий двухцепочечный участок, образованный одной из цепей матрицы и праймером. Для того чтобы праймер соединился с одной из цепей матрицы, он, естественно, должен быть этому участку цепи комплементарным. Таким образом, конец праймера определяет, в каком направлении будет идти синтез, а то, из каких букв состоит праймер, определяет, в каком месте он свяжется с ДНК-матрицей, потому что он может связаться только с комплементарным участком. Вы помните, что некомплементарные буквы друг с другом взаимодействовать не хотят. Итак, теперь, когда мы разобрали все необходимые теоретические моменты, давайте обсудим, как, собственно, проходит полимеразная цепная реакция. Мы смешиваем в пробирке несколько компонент, а именно: матрицу для синтеза, то есть длинную геномную ДНК, двухцепочечную; буфер; буквы, А, Т, Г, Ц, или нуклеотиды по-другому; праймеры — это одноцепочечные короткие фрагменты, которые комплементарны началу фрагмента, который мы хотим получить, и концу фрагмента, который мы хотим получить, то есть у нас должно быть два праймера — один для начала фрагмента, другой — для конца фрагмента; и ДНК-полимеразу. Ну, казалось бы, чтобы начался синтез, у нас праймеры должны связаться с одной из цепей ДНК хотя бы. Ну, каждый праймер со своей цепью. Но этого не происходит, потому что ДНК уже двухцепочечная молекула, и в ней цепи уже комплементарны друг другу. Им хорошо вместе, и третий здесь лишний. Для того чтобы разлучить цепи ДНК друг с другом, вы помните, что для них это, вообще-то, энергетически выгодно вместе находиться, нам нужно нашу реакцию нагреть. Мы нагреваем реакцию до температуры примерно 95–98 градусов, и при такой температуре цепи ДНК расходятся, отходят друг от друга. На самом деле праймеры все еще не могут связаться при этом с той или иной цепью ДНК, потому что температура реакции слишком высокая. Да, цепи теперь стремятся с кем-то связаться, но мы же подняли температуру и только что поговорили о том, что это приводит к тому, что связи между цепями ДНК при этом рушатся. Поэтому для того чтобы праймеры смогли, наконец, воссоединиться с комплементарными им участками матрицы, то есть геномной ДНК, необходимо температуру опустить. Мы опускаем температуру примерно до 60 градусов, это зависит от, на самом деле, конкретных праймеров и матрицы, ну, будем считать, около 60 градусов где-то в среднем. И при такой температуре вы видите, что праймеры связываются с соответствующими цепями ДНК, причем обратите внимание, именно в комплементарных участках и именно в конце и в начале нашего фрагмента, то есть на самом деле мы сделали праймеры так, чтобы ДНК-полимераза, когда вот она сейчас связалась с нашим комплексом праймера и матрицы, она от начала нашего фрагмента двигалась вправо, а от конца нашего фрагмента двигалась влево. Но для того чтобы вообще синтез начался, и ДНК-полимераза начала синтезировать новые последовательности ДНК, необходимо обеспечить комфортную для ее работы температуру, для разных ДНК-полимераз эта температура разная, обычно это около 72 градусов. Поэтому мы еще поднимаем температуру до 72 градусов. Теперь процесс пошел. ДНК-полимераза синтезирует одну цепь ДНК и включает в нее буквы, комплементарные матрице, то есть опять же напротив Т ставит А, напротив Г ставит Ц и так далее. И ДНК-полимераза так двигается, как вы можете здесь увидеть на этой схеме, синтезируя новую цепь какое-то время. На самом деле, какое время, определяется двумя параметрами. Во-первых, ДНК-полимераза просто не может двигаться вечно, и включив определенное количество букв в растущую цепь, — обычно это несколько тысяч, не больше, — она устает и отваливается. Но на самом деле можно контролировать, как долго будет идти синтез ДНК, еще и изменяя температуру в реакции после какого-то определенного промежутка времени. То есть, например, если мы снова нагреем реакцию до 98 или 95 градусов, то ДНК-полимераза отвалится от ДНК в тот момент, когда мы это сделаем. Таким образом, длина продукта определяется временем, которое ДНК-полимераза синтезирует новую цепь. Итак, как я уже сказал, мы, после того как ДНК-полимераза какое-то время включала буквы в новую цепь, поднимаем температуру снова, и у нас возвращается все к исходной ситуации, когда цепи разделились друг с другом, но только теперь цепей у нас стало больше. Кроме имевшейся в реакции матрицы еще есть две новые синтезированные цепи. И теперь мы повторяем все сначала. Мы опускаем температуру до 60 градусов, и вы видите, как с исходными молекулами матрицы, так и с вновь синтезированными молекулами могут связаться снова праймеры. Это и происходит. И мы снова поднимаем температуру до 72 градусов, и у нас снова происходит синтез молекул при помощи ДНК-полимеразы. Мы повторяем такой цикл: 98 — 60 — 72 еще раз, и еще раз, и еще раз. Посмотрите на изображение. Посмотрите на видео, что происходит. У нас образуется все больше и больше цепей, причем большинство из этих цепей цепей. Это как раз те фрагменты, которые мы хотели бы получить, то есть короткие фрагменты, ограниченные одним нашим праймером в начале и другим наши праймером — в конце. Ну, вы помните, что праймеры мы подбирали таким образом, чтобы у нас один из них именно соответствовал началу необходимого нам фрагмента и второй соответствовал концу необходимого нам фрагмента. То есть то, что мы получаем в конце, в большей степени, по большинству — это именно те... тот фрагмент, который мы хотели бы наработать, тот участок исходной матричной ДНК, которую мы хотели бы наработать. Есть и другие фрагменты, вы видите. Это как исходная матрица, так и более длинные фрагменты, которые только с одной стороны содержат наш праймер, а со второй стороны закончились тем, что просто ДНК-полимераза отвалилась по какой-то причине от матрицы, или из-за того, что температура поднялась, или из-за того, что она просто устала (как мы это называем, да?) синтезировать новую ДНК. Но таких длинных молекул намного меньше, чем нужных нам коротких. Можно посчитать, что через 35 циклов у нас коротких молекул будет примерно 17 миллиардов, а длинных молекул, которые содержат праймер на одном конце, около 35 копий, а молекул исходной матрицы — всего одна копия, что на самом деле по сравнению с 17 миллиардами — совершенно мизерное количество, которым можно спокойно пренебречь, и считать, что на выходе у нас получились только нужные нам целевые вот эти вот короткие участки. Ну, собственно, вот таким образом, при помощи полимеразной цепной реакции можно практически любой участок исходной ДНК наработать в таком количестве, что дальше забыть просто про исходную ДНК и все остальные примеси в этой реакции. На самом деле ПЦР — не такой абсолютно приемлемый во всех ситуациях метод, как может показаться на первый взгляд. У него есть ряд ограничений. Первое важное ограничение — это специфичность праймеров. На самом деле молекулы исходной геномной ДНК очень длинные, и очень часто так случается, что то, что является началом нашего искомого фрагмента, элемента, та последовательность, которую мы хотели бы включить в праймер или комплиментарная ей последовательность, встречается в геноме не один раз, а несколько. И тогда, когда мы подбираем праймеры, может оказаться, что они случайным образом свяжутся не с нужной нам последовательностью, а с какой-то другой, и на выходе наш ПЦР-продукт, то есть то, что мы получим в результате ПЦР-реакции будет совсем не тем, что мы хотим. Вторая проблема — это длина продукта. Как я сказал, даже если мы будем очень долго поддерживать температуру, комфортную для ДНК-полимеразы, то есть при которой она может синтезировать, она все равно через максимум несколько тысяч букв, нуклеотидов, отвалится от ДНК и прекратит синтез. Этим лимитирован максимальный размер ПЦР-продукта, который может вообще образоваться в реакции. Для большинства случаев это несколько тысяч нуклеотидов, ну, в некоторых случаях, используя специальные ДНК-полимеразы, можно получить продукты большие, несколько большие, чем 10000 букв или нуклеотидов. Ну, существенно больше, чем вот этот предел в 10000, поднять эффективность реакции уже нельзя, то есть сделать существенно больше продукта нельзя. Ну, тем не менее, эти проблемы можно решить с помощью других методов, о некоторых из них мы будем говорить буквально в следующей лекции. Зато у метода ПЦР есть много преимуществ. Одно из них, которое мы сейчас обсудим, совершенно замечательное и оно связано с тем, что на самом деле я сказал, что праймер должен быть комплиментарен матрице. Но это не совсем так. Комплиментарен должен быть только небольшой участок праймера, который находится вот именно на том конце, где будет связывание с ДНК-полимеразой, где у нас была стрелочка нарисована. На другом конце праймера можно добавлять нуклеотиды или буквы, которые не комплиментарны матрице. А поскольку все наши получаемые фрагменты, вот эти короткие фрагменты, которые нам нужны, они содержат праймеры на своих концах, то получается, что все наши фрагменты на концах могут содержать какие-то последовательности, которые, вообще говоря, исходно в матрице не присутствовали. И это очень удобно и полезно для последующих методов, о которых мы поговорим в следующей лекции.
