Знаете, как скрестить мышь с медузой? Или, может быть, хотите научиться собирать конструктор из вируса, человека и быка? В нашем курсе мы расскажем вам о том, какие «пазлы» уже умеют складывать учёные и как трансгенные технологии влияют на нашу жизнь. ГМО — эти три буквы держат в страхе весь мир. Сегодня больше 80% россиян боятся генетически модифицированных организмов, не подозревая о том, что их собственные организмы в своё время уже подверглись генетической модификации. На протяжении миллионов лет вирусы, первые «генные инженеры», успешно меняли геном человека, и каждый из нас на целых 8% вирус. Из нашего курса вы узнаете, что же такое ГМО и зачем человек создал технологии трансгенеза, как работает трансгенная конструкция и какими способами её можно доставить в клетку. Мы познакомим вас с новейшими системами редактирования генома, расскажем о том, как трансгенные животные помогают исследователям в борьбе с наследственными заболеваниями и старением. Вы собственными глазами увидите светящихся рыбок и мышей и побываете в лаборатории, где из опаснейших вирусов делают безопасные для того, чтобы они служили на пользу человечеству. Добро пожаловать на курс «ГМО: технологии создания и применение». Мы научим вас делать из мухи слона!
2.1. Ctrl+C для ДНК: полимеразная цепная реакция
Loading...
Из курса от партнера Novosibirsk State University
ГМО: технологии создания и применение
190 оценки
Explore Related Videos
At Coursera, you will find the best lectures in the world. Here are some of our personalized recommendations for you
Из урока
Создание трансгенных организмов
Второй модуль делится на 2 части. В первой из них мы расскажем и покажем, как в лаборатории создаются трансгенные конструкции и какие методы позволяют генным инженерам объединять в трансгенной конструкции ДНК самых разных видов. Из второй части модуля вы узнаете о самом распространённом способе создания трансгенных животных. Например, о том, как обычную козу можно превратить в биофабрику по производству белков человека. Кроме того, мы разберём молекулярные механизмы, встраивающие чужеродную ДНК в геном.
Познакомьтесь с преподавателями
Алексей Мензоровкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Нариман Баттулинкандидат биологических наук, старший преподаватель
Кафедра цитологии и генетики факультета естественных наук НГУ
Вениамин Фишманкандидат биологических наук, преподаватель
Кафедра молекулярной биологии факультета естественных наук НГУ
[ЗВУК] [ЗВУК] Здравствуйте!
Меня зовут Вениамин, и я буду читать часть лекций в этом курсе.
Сегодня мы поговорим о том,
как создавать конструкции для получения трансгенных организмов.
Вы уже знаете, что большинство, если не все элементы,
из которых состоят такие конструкции, позаимствованы биологами у природы,
то есть они содержатся в геномах тех или иных живых организмов.
Но в то же время вы знаете, что именно в той комбинации, в которой нам нужно,
элементы конструкции для получения трансгенного организма ни в каком из живых
организмов не представлены.
Как же нам быть?
Нам нужно научиться, значит, извлекать эти необходимые элементы из геномов
живых организмов и комбинировать их друг с другом.
Вот об этом мы будем говорить в течение нескольких лекций,
а сегодня поговорим именно о том,
как извлечь какую-то последовательность ДНК из генома организмов.
Сначал вспомним школьную программу о том, что же, вообще, такое ДНК.
Ну, ДНК — это химическая молекула,
основными строительными блоками которой являются химические вещества нуклеотиды.
Их бывает четыре типа, мы будем называть их буквами, и мы будем говорить,
что есть четыре буквы: А, Т, Г и Ц.
ДНК — это двухцепочечная молекула,
то есть одна длинная молекула ДНК состоит из двух цепей, и буквы,
которые составляют каждую из этих цепей, располагаются в них неслучайным образом.
Если в одной цепи находится буква А, то в другой цепи обязательно находится буква Т,
если в одной цепи буква Г, то в другой буква Ц.
Это называется правило комплементарности,
как будто буквы комплименты друг другу делают.
А всегда делает комплименты Т, а Г всегда делает комплименты Ц.
При этом А никогда не может стоять напротив Ц.
Это обусловлено химической природой самих веществ, которые, собственно,
и являются вот этими буквами, азотистых оснований.
Затем нужно сказать, что комплементарные участки ДНК комплементарны,
то есть вот именно такие, у которых нужные буквы — А напротив Т, Т напротив А,
Г напротив Ц, Ц напротив Г — они стремятся связаться друг с другом,
то есть они не просто вот так случилось, что они стоят друг напротив друга.
Как только у них появляется такая возможность, это для них именно
очень хорошо и очень выгодно соединиться друг с другом в двухцепочечную молекулу.
Теперь, когда мы вспомнили, что такое ДНК, поговорим о том,
как же извлечь какой-то фрагмент из этой молекулы.
На самом деле, я тут немножко слукавил.
Мы не то чтобы извлекаем какие-то фрагменты, мы просто берем исходную
геномную ДНК в очень небольшом количестве, а затем копируем какой-то нужный нам
элемент, какой-то нужный нам участок очень-очень-очень много раз,
так много раз, что в конечном счете у нас получается совсем-совсем чуть-чуть
исходные длинные молекулы, геномные ДНК, и огромное количество нужного нам фрагмента,
так что в сумме можно даже пренебречь исходной длинной молекулой.
Как же это делать?
Ключевую роль в этом процессе копирования,
которая называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР, играет фермент.
Ферменты, это вы помните, такие биологической природы катализаторы,
и фермент, который копирует ДНК, называется ДНК-полимераза.
Работает она в специальном буфере, который содержит определенные соли,
без них фермент неактивен.
И она строит новую молекулу ДНК из букв, вот этих самых букв — А, Т, Г, Ц.
То, какой же именно участок будет строить фермент ДНК-полимераза,
определяет праймер.
Праймер — это короткий одноцепочечный фрагмент ДНК.
То есть, обратите внимание, до этого все фрагменты, о которых мы говорили,
были двухцепочечными, а это одноцепочечный фрагмент,
который комплементарен началу или концу участка ДНК, который мы хотим скопировать.
Комплементарен — то есть содержит те самые нужные буквы: напротив А Т,
напротив Т — А.
Если комплементарен участку ТТТ, значит, содержит буквы ААА.
Еще одна особенность праймера заключается в том, что его концы,
начало и конец, неодинаковые.
Только с одним из концов может связаться ДНК-полимераза.
На рисунке этот конец обозначен стрелочкой.
И, собственно, то, с каким концом праймера связывается ДНК-полимераза,
определяет то, в каком направлении она будет двигаться, синтезируя новую цепь.
На самом деле, для того чтобы ДНК-полимераза начала синтез,
ей недостаточно только праймера.
Ей нужен короткий двухцепочечный участок,
образованный одной из цепей матрицы и праймером.
Для того чтобы праймер соединился с одной из цепей матрицы, он,
естественно, должен быть этому участку цепи комплементарным.
Таким образом, конец праймера определяет, в каком направлении будет идти синтез,
а то, из каких букв состоит праймер, определяет,
в каком месте он свяжется с ДНК-матрицей,
потому что он может связаться только с комплементарным участком.
Вы помните, что некомплементарные буквы друг с другом взаимодействовать не хотят.
Итак, теперь, когда мы разобрали все необходимые теоретические моменты,
давайте обсудим, как, собственно, проходит полимеразная цепная реакция.
Мы смешиваем в пробирке несколько компонент, а именно: матрицу для синтеза,
то есть длинную геномную ДНК, двухцепочечную; буфер; буквы,
А, Т, Г, Ц, или нуклеотиды по-другому; праймеры — это
одноцепочечные короткие фрагменты, которые комплементарны началу фрагмента,
который мы хотим получить, и концу фрагмента, который мы хотим получить,
то есть у нас должно быть два праймера — один для начала фрагмента,
другой — для конца фрагмента; и ДНК-полимеразу.
Ну, казалось бы, чтобы начался синтез,
у нас праймеры должны связаться с одной из цепей ДНК хотя бы.
Ну, каждый праймер со своей цепью.
Но этого не происходит, потому что ДНК уже двухцепочечная молекула,
и в ней цепи уже комплементарны друг другу.
Им хорошо вместе, и третий здесь лишний.
Для того чтобы разлучить цепи ДНК друг с другом, вы помните,
что для них это, вообще-то,
энергетически выгодно вместе находиться, нам нужно нашу реакцию нагреть.
Мы нагреваем реакцию до температуры примерно 95–98 градусов,
и при такой температуре цепи ДНК расходятся, отходят друг от друга.
На самом деле праймеры все еще не могут связаться при этом с той или иной цепью
ДНК, потому что температура реакции слишком высокая.
Да, цепи теперь стремятся с кем-то связаться,
но мы же подняли температуру и только что поговорили о том, что это приводит к тому,
что связи между цепями ДНК при этом рушатся.
Поэтому для того чтобы праймеры смогли, наконец, воссоединиться с комплементарными
им участками матрицы, то есть геномной ДНК, необходимо температуру опустить.
Мы опускаем температуру примерно до 60 градусов, это зависит от, на самом деле,
конкретных праймеров и матрицы, ну, будем считать,
около 60 градусов где-то в среднем.
И при такой температуре вы видите, что праймеры связываются с
соответствующими цепями ДНК, причем обратите внимание,
именно в комплементарных участках и именно в конце и в начале нашего фрагмента,
то есть на самом деле мы сделали праймеры так, чтобы ДНК-полимераза,
когда вот она сейчас связалась с нашим комплексом праймера и матрицы,
она от начала нашего фрагмента двигалась вправо,
а от конца нашего фрагмента двигалась влево.
Но для того чтобы вообще синтез начался,
и ДНК-полимераза начала синтезировать новые последовательности ДНК,
необходимо обеспечить комфортную для ее работы температуру,
для разных ДНК-полимераз эта температура разная, обычно это около 72 градусов.
Поэтому мы еще поднимаем температуру до 72 градусов.
Теперь процесс пошел.
ДНК-полимераза синтезирует одну цепь ДНК и включает в нее буквы, комплементарные
матрице, то есть опять же напротив Т ставит А, напротив Г ставит Ц и так далее.
И ДНК-полимераза так двигается,
как вы можете здесь увидеть на этой схеме, синтезируя новую цепь какое-то время.
На самом деле, какое время, определяется двумя параметрами.
Во-первых, ДНК-полимераза просто не может двигаться вечно,
и включив определенное количество букв в растущую цепь,
— обычно это несколько тысяч, не больше, — она устает и отваливается.
Но на самом деле можно контролировать, как долго будет идти синтез ДНК, еще и изменяя
температуру в реакции после какого-то определенного промежутка времени.
То есть, например, если мы снова нагреем реакцию до 98 или 95 градусов,
то ДНК-полимераза отвалится от ДНК в тот момент, когда мы это сделаем.
Таким образом, длина продукта определяется временем,
которое ДНК-полимераза синтезирует новую цепь.
Итак, как я уже сказал, мы,
после того как ДНК-полимераза какое-то время включала буквы в новую цепь,
поднимаем температуру снова, и у нас возвращается все к исходной ситуации,
когда цепи разделились друг с другом, но только теперь цепей у нас стало больше.
Кроме имевшейся в реакции матрицы еще есть две новые синтезированные цепи.
И теперь мы повторяем все сначала.
Мы опускаем температуру до 60 градусов,
и вы видите, как с исходными молекулами матрицы,
так и с вновь синтезированными молекулами могут связаться снова праймеры.
Это и происходит.
И мы снова поднимаем температуру до 72 градусов,
и у нас снова происходит синтез молекул при помощи ДНК-полимеразы.
Мы повторяем такой цикл: 98 — 60 — 72 еще раз,
и еще раз, и еще раз.
Посмотрите на изображение.
Посмотрите на видео, что происходит.
У нас образуется все больше и больше цепей,
причем большинство из этих цепей цепей.
Это как раз те фрагменты, которые мы хотели бы получить,
то есть короткие фрагменты,
ограниченные одним нашим праймером в начале и другим наши праймером — в конце.
Ну, вы помните, что праймеры мы подбирали таким образом,
чтобы у нас один из них именно соответствовал началу необходимого нам
фрагмента и второй соответствовал концу необходимого нам фрагмента.
То есть то, что мы получаем в конце, в большей степени,
по большинству — это именно те...
тот фрагмент, который мы хотели бы наработать,
тот участок исходной матричной ДНК, которую мы хотели бы наработать.
Есть и другие фрагменты, вы видите.
Это как исходная матрица, так и более длинные фрагменты, которые только с одной
стороны содержат наш праймер, а со второй стороны закончились тем,
что просто ДНК-полимераза отвалилась по какой-то причине от матрицы,
или из-за того, что температура поднялась, или из-за того,
что она просто устала (как мы это называем, да?) синтезировать новую ДНК.
Но таких длинных молекул намного меньше, чем нужных нам коротких.
Можно посчитать, что через 35 циклов у нас коротких молекул будет примерно
17 миллиардов, а длинных молекул, которые содержат праймер на одном конце,
около 35 копий, а молекул исходной матрицы — всего одна копия,
что на самом деле по сравнению с 17 миллиардами — совершенно мизерное
количество, которым можно спокойно пренебречь, и считать, что на выходе у нас
получились только нужные нам целевые вот эти вот короткие участки.
Ну, собственно, вот таким образом, при помощи полимеразной цепной реакции
можно практически любой участок исходной ДНК наработать в таком количестве,
что дальше забыть просто про исходную ДНК и все остальные примеси в этой реакции.
На самом деле ПЦР — не такой абсолютно приемлемый во всех ситуациях метод,
как может показаться на первый взгляд.
У него есть ряд ограничений.
Первое важное ограничение — это специфичность праймеров.
На самом деле молекулы исходной геномной ДНК очень длинные,
и очень часто так случается, что то,
что является началом нашего искомого фрагмента, элемента,
та последовательность, которую мы хотели бы включить в праймер или комплиментарная
ей последовательность, встречается в геноме не один раз, а несколько.
И тогда, когда мы подбираем праймеры, может оказаться,
что они случайным образом свяжутся не с нужной нам последовательностью,
а с какой-то другой, и на выходе наш ПЦР-продукт, то есть то,
что мы получим в результате ПЦР-реакции будет совсем не тем, что мы хотим.
Вторая проблема — это длина продукта.
Как я сказал, даже если мы будем очень долго поддерживать температуру,
комфортную для ДНК-полимеразы, то есть при которой она может синтезировать,
она все равно через максимум несколько тысяч букв, нуклеотидов,
отвалится от ДНК и прекратит синтез.
Этим лимитирован максимальный размер ПЦР-продукта,
который может вообще образоваться в реакции.
Для большинства случаев это несколько тысяч нуклеотидов, ну,
в некоторых случаях, используя специальные ДНК-полимеразы,
можно получить продукты большие, несколько большие, чем 10000 букв или нуклеотидов.
Ну, существенно больше, чем вот этот предел в 10000, поднять эффективность
реакции уже нельзя, то есть сделать существенно больше продукта нельзя.
Ну, тем не менее, эти проблемы можно решить с помощью других методов,
о некоторых из них мы будем говорить буквально в следующей лекции.
Зато у метода ПЦР есть много преимуществ.
Одно из них, которое мы сейчас обсудим,
совершенно замечательное и оно связано с тем, что на самом деле я сказал,
что праймер должен быть комплиментарен матрице.
Но это не совсем так.
Комплиментарен должен быть только небольшой участок праймера,
который находится вот именно на том конце, где будет связывание с ДНК-полимеразой,
где у нас была стрелочка нарисована.
На другом конце праймера можно добавлять нуклеотиды или буквы,
которые не комплиментарны матрице.
А поскольку все наши получаемые фрагменты, вот эти короткие фрагменты,
которые нам нужны, они содержат праймеры на своих концах, то получается,
что все наши фрагменты на концах могут содержать какие-то последовательности,
которые, вообще говоря, исходно в матрице не присутствовали.
И это очень удобно и полезно для последующих методов,
о которых мы поговорим в следующей лекции.
Ознакомьтесь с нашим каталогом
Присоединяйтесь бесплатно и получайте персонализированные рекомендации, обновления и предложения.
Coursera делает лучшее в мире образование доступным каждому, предлагая онлайн-курсы от ведущих университетов и организаций.
© Coursera Inc., 2019 Все права защищены.
