Продолжим разговор о методах исследования хроматина. Еще одной важнейшей характеристикой хроматина является доступность ДНК. Что это означает? Когда гены активны, хроматин, в котором они располагаются, более доступен для обработки внешними факторами. Когда гены не активны, он более плотно упакован, и ДНК в его составе защищена от воздействия внешних факторов. Какие факторы используются для обработки хроматина в лаборатории? В первую очередь, это микрококковая нуклеаза и выделенный из бактерии золотистый стафилококк. Чем замечателен этот фермент? Это неспецифическая нуклеаза, которая разрезает и деградирует ДНК, не связанную с гистоновыми молекулами. Таким образом, при обработке микрококковой нуклеазы хроматин разрушается до состояния одиночных нуклеосом, то есть фрагментов ДНК, намотанных на гистоновые молекулы. Таким образом, мы определяем, в каких местах в данном клеточном типе располагаются нуклеосомы. Это важно, например, для того, чтобы определить и охарактеризовать генную активность. Дело в том, что при транскрипции гена, когда РНК-полимераза движется вдоль гена и считывает с него транскрипт, нуклеосомы фазируются. То есть они организуют очень определенную регулярную структуру, особенно в начале гена. Когда ген неактивен, такая структура не формируется, и этот признак является достаточно важным во многих случаях, чтобы охарактеризовать генную активность, и также изучать, собственно, процесс транскрипции. Второй фермент, который используется для такого рода исследований — это ДНКаза I, выделенная из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Этот фермент обладает немного другой активностью. В частности, он разрезает свободную ДНК в тех местах, где нет нуклеосом, и обычно в этих местах располагаются какие-либо регуляторные элементы генома, которые отвечают за активацию генов, располагающихся поблизости от этого района. Так вот, когда мы обрабатываем хроматин ДНКазой I, мы можем в полногеномном масштабе определить именно эти участки, которые обладают потенциальной регуляторной активностью. Еще один метод, который называется FAIR, основан на очень простой идее: свободная ДНК при разрушении часто остается в водном растворе, в то время как ДНК, связанная с белками — эту ДНК можно осадить, поэтому получаются две фракции: одна фракция растворимая, другая нерастворимая в воде. Поэтому, проанализировав по отдельности эти фракции, мы можем определить, какие участки более доступны в данном типе клеток, какие менее доступны в этом же типе клеток. И, наконец, наиболее продвинутый метод, который называется ATAC, объединяет в себе достоинство обработки микрококковой нуклеазы и ДНКазы I. Он основан на том, что фермент транспозаза способен встраивать в ДНК определенную последовательность ДНК, опять же, и таким образом мы имеем возможность не только определять доступные сайты, но и сразу же их помечать для дальнейшего анализа высокопроизводительным секвенированием. И этот метод обладает замечательным свойством, что он определяет как участки регуляторные, которые можно определять с помощью ДНКазы I, так и расположение нуклеосом, которое мы определяем с помощью микрококковой нуклеазы. И на настоящий момент это, наверное, наиболее часто используемый и высокопроизводительный метод исследования хроматина, его общих свойств. Описанные нами методы могут использоваться как сами по себе, так и в комбинациях. И, как оказывается, зачастую использование комбинации двух методов дает более качественный результат, чем каждый из них по отдельности. Например, в прошлые лекции мы описывали метод иммунопреципитации хроматина, и упоминали, что ключевым моментом для качественного результата, является фрагментация ДНК в составе хроматина. Чем меньше мы получаем фрагменты ДНК, тем точнее мы в итоге определяем сайт связывания исследуемого нами белка. Но оказалось, что разрешающую способность можно еще повысить, потому что если мы используем микрококковую нуклеазу, то она деградирует всю ДНК, которая защищена белками, и в первую очередь — это, конечно, ДНК, связанная с нуклеосомами, намотанная на гистоновые белки, но также хорошо защищают ДНК сами транскрипционные факторы, которые связаны с конкретной последовательностью ДНК. Таким образом, микрококковая нуклеаза очень сильно сужает те фрагменты, с которыми связывается, именно транскрипционные факторы. Поэтому, когда мы используем метод иммунопреципитации хроматина на обработанном таким образом хроматине, мы очень сильно повышаем его разрешающую способность, потому что фактически мы выделяем только те участки ДНК, с которыми был связан исследуемый нами белок, и который этот белок защитил от деградации микрококковой нуклеазой. И, таким образом, профиль связывания белка, который мы получаем в результате этого метода, гораздо более точен, чем при классическом методе иммунопреципитации хроматина, дает больше конкретной информации и, соответственно, гораздо более информативен в биохимических исследованиях. Таким образом, используя описанные выше методы, мы получаем важнейшую информацию для эпигенетических исследований. Это информация о том, как устроен хроматин в конкретном месте или в рамках всего генома, и используя эту информацию, объединяя эту информацию с другими исследованиями, мы можем строить те самые модели, которые мы потом обнаруживаем в учебниках по молекулярной биологии и по молекулярной генетике.
