[МУЗЫКА] «ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРОЦЕДУРЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ И СЕКВЕНИРОВАНИЯ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОМОВ» Здравствуйте, меня зовут Екатерина Черняева, я работаю в лаборатории геномной биоинформатики Санкт-Петербургского Государственного университета. Сегодняшнее занятие будет посвящено знакомству с работой в молекулярной генетической лаборатории. Начну я свой рассказ с описания основных задач, которые стоят перед сотрудниками лаборатории. Основной целью работы лаборатории является получение новых данных о геномах различных организмов, в частности мы изучаем геномы различных бактерий, позвоночных и беспозвоночных животных. Для того чтобы реализовывать эту работу перед нами стоят следующие задачи: 1. Получить генетический материал из клеток и тканей. 2. Проанализировать качество геномной ДНК. 3. Провести подготовку образцов геномной ДНК для дальнейшего секвенирования генома. 4. И осуществить секвенирование генома. Каждый из этих этапов требует специализированного оборудования. Кроме того, их необходимо проводить в различных помещениях. Например, выделение ДНК необходимо проводить в вытяжном шкафу, поскольку производится работа с высокотоксичными веществами, такими, как спирты, фенол, хлороформ. Этап подготовки к реакциям амплификации ДНК или ПЦР — процесса, позволяющего увеличить количество копий определенных участков генома, — необходимо проводить в специализированном боксе, куда никогда до этого не попадали продукты ПЦР-реакции, поскольку они могут загрязнить чистые реактивы и в дальнейшем негативно повлиять на получаемый результат. Несмотря на то, что в этой лаборатории мы не работаем с опасными патогенами, необходимо все равно соблюдать меры безопасности, связанные с тем, что проводится работа с токсичными веществами и электротехникой. Кроме того, необходимо работать таким образом, чтобы биологический материал исследователя, например, слюна, клетки кожи, волосы, не загрязнял материал, с которым он работает, поскольку это тоже может исказить получаемый результат. Именно поэтому в лаборатории необходимо соблюдать чистоту и порядок. Для соблюдения мер безопасности мы надеваем халаты и перчатки, перчатки необходимо регулярно менять. Начнем с первого этапа работы — выделение геномной ДНК, которую мы рассмотрим на примере выделения ДНК из бактериальных клеток. Мы взяли клетки кишечной палочки (Escherichia coli), принцип выделения ДНК, который мы рассмотрим, справедлив для многих бактерий и эукариот. Методики выделения ДНК из различных организмов отличают небольшие модификации. Клетки Escherichia coli были выращены в специализированной питательной среде. Для того чтобы выделить ДНК, нам необходимо провести лизис клеток. Для этого мы переносим суспензию клеток в пробирку, чтобы в дальнейшем осадить клетки с помощью центрифуги [БЕЗ СЛОВ] и избавиться от питательной среды. Центрифугирование занимает около 5 минут. После завершения центрифугирования мы вынимаем пробирки из центрифуги. Видно осадок клеток Escherichia coli, а сверху — это питательная среда, в которой она выращивалась. Для того чтобы дальше выделить ДНК, нам необходимо удалить эту питательную среду. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Следующим этапом будет лизис клеток. Мы для этого будем использовать специальный фермент лизоцим, который разрушает клеточные стенки и плазматические мембраны бактерий. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Получаем клеточную суспензию. [БЕЗ СЛОВ] Чтобы избавится от примесей РНК, которые нам не нужны для дальнейшего полногеномного секвенирования, добавляем специальный фермент РНКазу. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Далее нужно клетки в растворе лизоцима и РНКазы хорошо перемешать, для этого мы будем использовать вортекс. Ферментативная реакция будет проходить при 37 °С в специальном термостате. После инкубации вынимаем пробирки из термостата и добавляем следующие компоненты: детергент [БЕЗ СЛОВ] и фермент, который разрушит белки, содержащиеся в растворе. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Использование фермента протеина азк решает несколько проблем. Во-первых, разрушаются белки, которые связаны с ДНК, а также ингибируются ферменты, способные разрушить ДНК — ДНКазы. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Перемешиваем… Далее, оставляем в термостате при температуре 55 ° в течение часа. После завершения реакции, в растворе, который ранее содержал бактериальную суспензию, теперь содержится ДНК, сахара, липиды, переваренные белки, компоненты растворов, которые мы использовали для ферментативных реакций, а так же сами ферменты. Для того чтобы работать с ДНК, нам необходимо избавиться от органических примесей, которые содержат наш раствор. Для этого мы будем использовать смесь фенола и хлороформа. Фенол является органическим растворителем, который разрушает ДНК-белковые связи, денатурирует белки и способен растворять органические неполярные молекулы. ДНК, которая является полярной молекулой, не растворяется в феноле, а остается в водной фазе. Фенол несколько тяжелей воды, его плотность составляет 1,07 г/см³ и поэтому для того, чтобы утяжелить нашу смесь, мы добавляем еще один органический растворитель — хлороформ, его плотность составляет 1,47 г/см³. Оба раствора: и фенол, и хлороформ, являются токсичными, и поэтому мы работаем в вытяжном шкафу. Добавляем смесь фенола и хлороформа к раствору, где у нас денатурированы все белки, и аккуратно перемешиваем. Далее необходимо центрифугировать эту пробирку для того, чтобы разделить водную фазу и органическую фазу. В результате центрифугирования наша смесь разделилась на две фракции по плотности: верхнюю фракцию, более легкую, содержащую водный раствор ДНК; нижнюю более плотную, состоящую из фенола и хлороформа, а также растворенных в них органических примесей и интерфазу, которая состоит из денатурированных белков. Далее, нам необходимо перенести верхнюю фазу, содержащую раствор ДНК, в чистую пробирку. [БЕЗ СЛОВ] Это необходимо делать очень аккуратно, стараясь не задеть интерфазу с белками. Далее, мы повторим очистку раствора ДНК от примесей белков с использованием фенола и хлороформа вторично. Далее избавляемся от остатков фенола, используя хлороформ. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Аккуратно перемешиваем и центрифугируем. [БЕЗ СЛОВ] [БЕЗ СЛОВ] Вынимаем пробирку из центрифуги и переносим верхнюю фазу, содержащую ДНК, в чистую пробирку. [БЕЗ СЛОВ] Раствор ДНК, который содержится в данной пробирке, содержит примеси различных химических реактивов, которые мы использовали для выделения ДНК. Для того чтобы избавиться от них, необходимо осадить ДНК. Этот процесс можно сделать с использованием спирта в присутствии солей. Добавляем соль (натрий хлор) и изопропанол (спирт). Перемешиваем раствор. В результате мы можем увидеть небольшие белые хлопья — это преципитирующая ДНК. Процесс осаждения ДНК лучше происходит в холодных условиях, поэтому пробирку лучше поставить минут на 30 на −20 °. Прошло 30 минут. Теперь мы поставим нашу пробирку в центрифугу и будем центрифугировать около 15—20 минут. После центрифугирования ДНК осела, можно увидеть белый осадок на дне пробирки. Теперь необходимо отобрать спирт аккуратно, не задев осадок. Далее, промываем ДНК этанолом 70 % для того, чтобы избавиться от солей, и центрифугируем. [БЕЗ СЛОВ] Промывку этанолом 70 % производят 2 раза и после этого необходимо его удалить и подождать пока этанол испариться. Спустя некоторое время, ну минут 20, например, спирт испаряется и мы можем уже растворить нашу ДНК в растворе, например, воды, либо специального буфера, содержащего трис-HCl, который ингибирует воздействие ферментов, которые способны разрушить ДНК. Растворяем осадок ДНК. [БЕЗ СЛОВ] Если мы хотим, чтобы наша ДНК была интактной, в ней было как можно меньше разрывов, мы можем оставить ДНК растворяться в течение нескольких дней при температуре 4 °, но если нам необходимо тут же ее проанализировать и мы заинтересованы в получении быстрого результата, можно поппетировать немного и растворить ДНК. В результате мы получаем бесцветный раствор, который содержит очищенную ДНК Escherichia coli, кишечной палочки. Помимо продемонстрированного способа очистки ДНК, мы можем очистить ДНК, используя сорбенты, специфически связывающие заряженные нуклеиновые кислоты. На этом принципе основаны очень многие коммерческие наборы, предоставляющие возможности очищать ДНК на лабораторном столе. Таким образом, решается проблема работы с токсичными растворами и нам необходим вытяжной шкаф для работы. Для того чтобы выделить ДНК таким способом, исследователь сначала разрушает клетки точно так же, как это делали мы, а далее наносит раствор, содержащий ДНК, на специальную колонку, которая состоит из сорбента. В качестве сорбента используют оксид кремния. Отрицательно заряженные ДНК связываются с положительно заряженным сорбентом, а липиды, белки, полисахариды не связываются с ним. Далее проводится несколько этапов промывки сорбента, которая позволяет избавиться от неспецифически связавшихся веществ, а после этого ДНК элюируют в пробирку с помощью специального буфера, либо воды. [БЕЗ СЛОВ]
