[ЗАСТАВКА] [ЗАСТАВКА] Добрый день! Сегодняшняя лекция будет посвящена обзору технологии секвенирования ДНК, методов, которые широко применяются для фундаментальных и прикладных исследований в области медицины и биологии. Возможно, для кого-то из вас сегодня прозвучит достаточно большое количество новых молекулярно-биологических и биохимических терминов. Не пугайтесь этого! Основной целью сегодняшней лекции является объяснение основных принципов секвенирования, принципов профподготовки, для того чтобы в дальнейшем вы могли правильно анализировать получаемые данные и правильно ставить перед собой экспериментальные задачи. Начнем с первого определения. Секвенированием ДНК называют подход определения нуклеотидной последовательности молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты. Еще со школьной программы мы знаем, что молекула ДНК является полимером, состоящей из четырех типов мономеров, четырех типов различных нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов можно определить, применив один из методов секвенирования ДНК. Основные термины и понятия, которые нам пригодятся в сегодняшней лекции, представлены на данном слайде. Геномными библиотеками называют коллекцию геномной ДНК, полученную от одного организма и подготовленную для секвенирования. Секвенсным прочтением или «ридом» называют нуклеотидную последовательность, определенную с помощью прибора для секвенирования (секвенатором). Производительностью секвенатора называют набор секвенсных прочтений, полученых во время одного запуска секвенатора. Обычно эта величина выражается в количестве прочитанных нуклеотидов: тысяча нуклеотидов, сотни тысяч, миллионы, миллиарды... Уровнем ошибок называют долю неправильных нуклеотидов, определенных при секвенировании. Любой секвенатор допускает то или иное число ошибок при своей работе и уровень ошибок для каждой технологии секвенирования свой. И вот таким образом мы можем предугадать, какое же количество неправильных нуклеотидов будет находиться в наших данных после завершения процедуры секвенирования ДНК. Первые методы секвенирования были разработаны в 70-х годах XX века и названы они в честь разработчиков. Это методы Максама Гилберта и Сэнгера. Результаты секвенирования вы можете видеть на данном слайде. Это электрофореграммы, но с первого взгляда не совсем понятно, каким же образом можно определить первичную последовательность ДНК, нуклеотидную последовательность, глядя на эти электрофореграммы. Метод Максама Гилберта, разработанный Аланом Максамом Уолтером Гилбертом, заключается в следующем: пробу, содержащую меченную на одном из концов молекулу ДНК помещают в 4 разные пробирки, в каждой из которых проводят 4 разные биохимические реакции. Во время этих реакций происходит модификация одного или двух азотистых оснований, входящих в состав молекулы ДНК. После этого проводят расщепление молекулы именно в том месте, где произошла модификация нуклеотида, и таким образом получают расщепленные молекулы ДНК, более укороченные, чем исходные молекулы. Условия реакции подбирают таким образом, чтобы модифицировались не все нуклеотиды определенного типа, а только часть из них. И таким образом, в результате, получают в каждой из пробирок набор субфрагментов ДНК разной длины. После этого можно провести электрофоретическое разделение ДНК, и восстановить первичную последовательность молекулы ДНК, которую экспериментатор анализирует. Метод, разработанный Фредериком Сэнгером несколько отличался от рассмотренного нами ранее метода. Он основан на ферментативном копировании изучаемой молекулы ДНК и включения в растущую цепь терминирующих аналогов нуклеотидов, так называемых «терминаторов». Для того чтобы провести секвенсную реакцию, необходимо взять молекулу ДНК, которую мы будем изучать, нуклеотидную последовательность которой мы будем определять; праймер, который является затравкой любой полимеразной реакции; нуклеотиды, которые будут включаться в растущую нуклеотидную цепь; полимеразу, которая будет синтезировать растущую цепь, а также терминирующие аналоги нуклеотид трифосфат. Всего существует 4 типа нуклеотидов, всего существует точно также 4 типа терминирующих аналогов. Проводили 4 реакции в разных пробирках, в каждую из которых добавляли свой терминатор. Таким образом, включаясь в растущую цепочку ДНК, при полимеразной реакции, реакция обрывалась при включении терминирующего аналога. Соотношение обыкновенных нуклеотидов и терминирующих аналогов подбирали таким образом, чтобы в результате получали фрагменты ДНК разной длины. После этого проводили электрофоретическое разделение продуктов. Продукт каждой из реакции вносили в разную дорожку геля и определяли первичную последовательность молекулы ДНК, которую мы брали в реакцию для изучения ее нуклеотидного состава. Этот метод получил широкое распространение, поскольку он был автоматизирован, а именно автоматизирована была технология детекции результатов электрофоретического разделения, все результаты можно было перевести в такие хроматограммы, как мы видим сейчас на данном слайде. Это позволяло достаточно быстро и безошибочно определять нуклеотидную последовательность любого гена и каким-то образом получать новые данные. Первым геномом, который был просеквенирован с помощью данной технологии, был геном бактериофага phiX174. Количество ошибок, которые производили секвенаторы, основанные на методе секвенирования по Сэнгеру, составляло, где-то, от 0,1 до 1 %. А длина прочтения составляла от 300 до 1000 пар нуклеотидов. Как мы видим, что любой геном является намного больше, чем максимальная длина прочтения с помощью данной методики. И для того чтобы просеквенировать геном целиком, необходимо применить какой-то подход, который нам позволит просеквенировать геном более 1000 пар нуклеотидов. Давайте разберемся, что же необходимо для этого сделать. После того как мы выделили ДНК из клетки, нам необходимо провести фрагментацию этой ДНК. Случайным образом разрезать ДНК на небольшие фрагменты, далее эти фрагменты необходимо клонировать в составе векторов — это небольшие кольцевые молекулы ДНК, которые способны нести фрагменты чужеродные ДНК и реплицироваться в составе бактериальных клеток. После проведения трансформации бактериальных клеток вектором, несущим фрагменты ДНК, секвенс которых мы хотим получить, бактерии начинают расти и увеличивать количество копий той ДНК, которую мы хотим просеквенировать. Мы выделяем молекулу ДНК из этих бактерий и начинаем секвенировать в библиотеке. А далее, получая достаточно большое количество нуклеотидных прочтений, которые необходимо собрать в одну непрерывную цепочку и использовать для решения своих собственных научных задач. Секвенирование по Сэнгеру имеет как положительные, так и отрицательные черты. Среди положительных это, безусловно, низкая частота ошибок и удобство при секвенировании небольшого количества коротких фрагментов ДНК, ну а среди негативных черт: высокая стоимость секвенирования полных геномов, высокая трудоемкость, если нам необходимо секвенировать большое количество фрагментов ДНК, и низкая производительность секвенаторов. [ЗАСТАВКА]
